實時熒光定量PCR技術,是指在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程,最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。PCR實驗是分子生物學中常見用的實驗之一,在基因擴增、核酸檢測、基因檢測等方面廣泛應用。PCR實驗前的準備:
在開始PCR實驗之前,必須準備好DNA模板(基因組DNA或逆轉(zhuǎn)錄制備的cDNA)、特異性引物(自己設計或用軟件設計),并選擇合適的商業(yè)酶(選擇符合您實驗目的的酶)
2、引物的特異性影響 PCR 成功的概率,良好的引物設計對 PCR 擴增的成功至關重要。當您開始設計引物時,應仔細考慮以下幾個原則:
①引物的長度。PCR引物一般在18-22bp左右。這對于引物特異性和在退火溫度下的結(jié)合來說是足夠長的。
②熔化溫度(Tm)。Tm 定義為在此溫度下,DNA 雙鏈體的一半將解離成單鏈 DNA。52-58C 范圍內(nèi)的引物 Tm 是最佳的。
③GC 含量。最佳 GC 含量應為 40-60%。
④許多軟件可用于引物設計,例如primer5和Oligo。這些軟件推薦的引物通??梢詽M足我們的需求。