日本中文字幕在线视频,中文字幕二区三区,老色批视频一区二区,wwwav道

產(chǎn)品展示
PRODUCT DISPLAY
技術(shù)支持您現(xiàn)在的位置:首頁 > 技術(shù)支持 > ELISA試劑盒各種檢測(cè)方法共同操作過程陳述
ELISA試劑盒各種檢測(cè)方法共同操作過程陳述
  • 發(fā)布日期:2024-05-27      瀏覽次數(shù):262
    •        酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay,ELISA)是免疫學(xué)和分子生物學(xué)中廣泛使用的實(shí)驗(yàn)室技術(shù), ELISA檢測(cè)是一種免疫檢測(cè)方法,通常用于測(cè)量生物樣品中的抗體或抗原,包括蛋白質(zhì)或糖蛋白。像其他免疫檢測(cè)法一樣,它們依靠抗體與目標(biāo)的結(jié)合來促進(jìn)檢測(cè)。

      ELISA技術(shù)不同檢測(cè)方法具備以下共同操作過程:

      1、板包被

      大多數(shù)ELISA檢測(cè)第一步是將檢測(cè)的第一個(gè)成分與包被板結(jié)合。這通常是通過被動(dòng)吸附完成的,一個(gè)非特異性的過程,所以結(jié)果將取決于涂在包被板上的東西。

      如果使用了含有抗原的樣品,那就需要一個(gè)具有選擇性的包被板,因?yàn)楦鞣N抗原都會(huì)結(jié)合,而不僅僅是那些感興趣的。然而,如果像用于抗體檢測(cè)的ELISA間接法那樣使用純化抗原,或像ELISA夾心法那樣使用捕獲抗體,那么我們已經(jīng)準(zhǔn)備了一個(gè)具有選擇性的包被板。

      包被板的類型大多數(shù)是[C8H8]n或[C8H8]n衍生物,其具有不同的結(jié)合特性,這取決于目標(biāo)物質(zhì)和檢測(cè)的性質(zhì)。一些目標(biāo)物質(zhì),包括重度糖基化的蛋白質(zhì)、碳水化合物、DNA、脂類、短肽和有洗滌劑的蛋白質(zhì),是不能很好吸附的。在這些情況下,建議使用經(jīng)過處理允許共價(jià)連接到表面的包被板。

      2、孵育

      將試劑加入ELISA板后,必須進(jìn)行孵育,以便有時(shí)間進(jìn)行結(jié)合或反應(yīng)。每次孵育的溫度和時(shí)間將取決于檢測(cè)步驟和正在進(jìn)行的操作。通常在樣品應(yīng)用之后,與37℃下孵育1小時(shí)。

      然而,像阻斷這樣的步驟可以在冰箱中過夜,測(cè)定過程中的孵育通常在室溫下進(jìn)行,時(shí)間短得多。

      3、洗滌

      洗板是在應(yīng)用在檢測(cè)每個(gè)組成部分之間,直到結(jié)果測(cè)定的一個(gè)重要步驟。溶液從孔中排空后,通常使用磷酸鹽緩沖鹽水-20(PBST)做為緩沖液清洗孔,以去除任何殘留的未結(jié)合抗原、抗體或試劑。

      這可以用多通道移液器手工完成,或使用自動(dòng)洗板機(jī)。

      不充分的清洗可能會(huì)導(dǎo)致高背景信號(hào),而過多的清洗會(huì)導(dǎo)致樣品信號(hào)低。不一致的清洗可能會(huì)導(dǎo)致整個(gè)板塊的不一致,從而導(dǎo)致不可靠的結(jié)果。

      4、阻斷

      在用蛋白質(zhì)包被ELISA板后,阻斷通常是必要的,以防止在接下來方案步驟中測(cè)定抗體的任何非特異性結(jié)合。

      與檢測(cè)無關(guān)的混合蛋白被添加到板中并進(jìn)行孵育,占據(jù)任何可用的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。常見的蛋白質(zhì)阻斷緩沖液選擇包括脫脂干乳、牛血清白蛋白(BSA)和酪蛋白。

      另外,非離子洗滌劑,如Tween 20或Triton X-100,可作為阻斷劑使用,但不能像蛋白質(zhì)那樣提供永jiu性阻斷。無效的板塊阻斷會(huì)導(dǎo)致背景噪音增加,降低檢測(cè)的靈敏度和特異性。

      5、抗體

      實(shí)驗(yàn)性抗體是大多數(shù)ELISAs的基石,選擇正確的抗體至關(guān)重要,特別是在使用多種抗體的情況下。單克隆抗體和多克隆抗體都可以使用,它們都有各自的有點(diǎn)和缺點(diǎn)。單克隆抗體提供高特異性,但成本較高。另一方面,多克隆抗體可以在多個(gè)結(jié)合點(diǎn)與目標(biāo)結(jié)合,放大信號(hào)并提高靈敏度。

      使用采用二級(jí)抗體的方法增加了額外的步驟,延長了檢測(cè)時(shí)間,增加了出錯(cuò)機(jī)會(huì),需要更多優(yōu)化來找到合適的兼容抗體對(duì)。然而,使用多克隆二級(jí)抗體所帶來的靈敏度提高可能使其成為一種值得或必須的有效檢測(cè)方法發(fā)展方向。

      6、測(cè)定

      無論使用哪種ELISA類型,最后一步都是測(cè)定步驟,最常見的是利用酶介導(dǎo)的可見顏色變化化學(xué)反應(yīng),然后可以用紫外-可見分光光度法測(cè)量。

      酶結(jié)合抗原或抗體被應(yīng)用到測(cè)試孔中,如果目標(biāo)存在,它就會(huì)與之結(jié)合。當(dāng)酶的適當(dāng)?shù)孜锉惶砑拥桨话迳蠒r(shí),它會(huì)引起顏色變化,與孔內(nèi)結(jié)合的目標(biāo)物的數(shù)量成正比。辣根過氧化物酶(HRP)是一種常用共軛物,一般與底物3,3',5,5'-四甲基C6H6胺(TMB)合作使用。底物在HRP的作用下變成藍(lán)色,然后在加入硫酸溶液后變成黃色,停止反應(yīng)。

      然后可以用酶標(biāo)儀(在TMB加入終止液后,在450nm波段測(cè)定),這是一種紫外可見分光光度計(jì),來確定每個(gè)孔的吸光度值,并根據(jù)檢測(cè)設(shè)計(jì)進(jìn)行校正和計(jì)算,如減去空白孔平均值、技術(shù)重復(fù)平均值或與標(biāo)準(zhǔn)比率計(jì)算。


    聯(lián)系方式
    • 電話

      021-57763112

    • 傳真

      86-021-57690166

    在線客服