更新時間:2023-10-26
Ar A4 感受態(tài)細胞100ul*100菌株一種常用于質(zhì)??寺〉木?。其φ80lacZΔM15基因的產(chǎn)物可與pUC載體編碼的b-半乳糖苷酶氨基端實現(xiàn)a互補,可用于藍白斑篩選。recA1和endA1 的突變有利于克隆DNA 的穩(wěn)定和高純度質(zhì)粒DNA的提取。
Ar A4 感受態(tài)細胞100ul*10操作方法(以下操作均按無菌條件的標準進行)
1 取感受態(tài)細胞置于冰浴中,如需分裝可將剛?cè)诨毎麘乙悍盅b到無菌預冷的離心管中,置于冰浴中。
● 一次轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞的建議用量為50-100 μl,可以根據(jù)實際情況分裝使用。應注意所用DNA 體積不要超過感受態(tài)細胞懸液體積的十分之一。
以下實驗以100 μl感受態(tài)細胞為例。
Ar A4 感受態(tài)細胞100ul*102 向感受態(tài)細胞懸液中加入目的DNA(100 μl 的感受態(tài)細胞能夠被1 ng 超螺旋質(zhì)粒DNA 所飽和),輕輕旋轉(zhuǎn)離心管以混勻內(nèi)容物,在冰浴中靜置30 分鐘。
3 將離心管置于42℃水浴中放置60-90 秒,然后快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中,使細胞冷卻2-3 分鐘,該過程不要搖動離心管。
4 向每個離心管中加入900 μl 無菌的SOC 或LB 培養(yǎng)基(不含抗生素), 混勻后置于37℃搖床振蕩培養(yǎng)1 小時(160-220 轉(zhuǎn)/分鐘),目的是使質(zhì)粒上相關的抗性標記基因表達,使菌體復蘇。
Ar A4 感受態(tài)細胞100ul*105 將離心管內(nèi)容物混勻,吸取100 μl 已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞加到含相應抗生素的SOB 或LB 固體瓊脂培養(yǎng)基上,用無菌的彎頭玻棒輕輕的將細胞均勻涂開。將平板置于室溫直至液體被吸收,倒置平板,37℃培養(yǎng)12-16 小時。
● 涂布用量可根據(jù)具體實驗來調(diào)整。如轉(zhuǎn)化的DNA 總量較多,可取更少量轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布平板;反之,如轉(zhuǎn)化的DNA 總量較少,可取200-300 μl 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布平板。如果預計的克隆較少,可通過離心(4,000 rpm, 2分鐘)后吸除部分培養(yǎng)液,懸浮菌體后將其涂布于一個平板中。(涂布剩余的菌液可置于4℃保存,如果次日的轉(zhuǎn)化菌落數(shù)過少可以將剩下的菌液再涂布新的培養(yǎng)板)
注意事項
1. 感受態(tài)細胞應保存在 -70℃,不可多次凍融和放置時間過長,以避免降低感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化效率。
2. 進行轉(zhuǎn)化操作時,應根據(jù)相應溫度及無菌條件的要求進行。
3 為防止轉(zhuǎn)化實驗不成功,可以保留部分連接反應液,以重新轉(zhuǎn)化,將損失降到低。
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